一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />　　
　　掌握人類外周血細(xì)胞培養(yǎng)方法及染色體標(biāo)本的制備方法。觀察人類染色體的形態(tài)和數(shù)目。
　　
　　二、實(shí)驗(yàn)原理
　　
　　血液中的T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)中經(jīng)一定劑量的植物血凝素（PHA）刺激，可以返幼進(jìn)行細(xì)胞分裂，用秋水仙素積累分裂相，用0.075mol/L-1KCI進(jìn)行低滲后，經(jīng)固定、染色，可見(jiàn)到分散的染色體。
　　
　　三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
　　
　　超凈工作臺(tái)、紅外線滅菌器（艾本森儀器公司）、無(wú)菌注射器（1ml、2ml、5m1）、針頭、培養(yǎng)瓶、橡皮塞、75％酒精棉球、離心機(jī)、定時(shí)鐘、試管架、量筒、刻度離心管、冰涼玻片，毛細(xì)滴管、恒溫水浴鍋、RPMI1640、小牛血清、肝素、秋水仙素、植物血凝素（PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸為3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配）、0.075mol。L-1KCI低滲液、Giemsa染液、pH6.8磷酸緩沖液、恒溫培養(yǎng)箱、吹風(fēng)機(jī)、粗天平、5％NaHCO3、顯微鏡。
　　
　　四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟
　　
　?。ㄒ唬┙臃N
　　
　　取500單位/lml的肝素0。2ml濕潤(rùn)針筒后，取靜脈血1～2ml，轉(zhuǎn)動(dòng)針筒以混勻肝素；隨后立即插入滅菌小瓶?jī)?nèi)，送入超凈工作臺(tái)（消毒、滅菌等略），在紅外線滅菌器旁將血液滴入2～3個(gè)盛有5ml培養(yǎng)液（4mlRPMIl640、lml小牛血清，5mgPHA，用5％的NaHCO3調(diào)pH至7.0～7.4）的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶0.2～0.3ml（7號(hào)針頭13滴），蓋上橡皮塞，輕輕搖動(dòng)以混勻。
　　
　　（二）培養(yǎng)
　　
　　1．將培養(yǎng)瓶放在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h。
　　
　　2．在終止培養(yǎng)前2～4h，將0.01％的秋水仙素1～2滴（7號(hào)針頭）加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，輕輕搖勻．放回溫箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2～4h。
　　
　　（三）收獲
　　
　　1．用吸管充分吹打瓶壁，吸取培養(yǎng)物移入刻度離心管內(nèi)，相對(duì)離心管平衡后放入離心機(jī)，離心8min（1000轉(zhuǎn)/分），吸去上清液，留下沉淀物。
　　
　　2．低滲處理：加8ml預(yù)溫（370C）的0.075mol。L-1KCI低滲液，用吸管打勻使細(xì)胞懸
　　
　　浮于低滲液中，放回37℃恒溫水浴鍋中，靜置15～20min，使白細(xì)胞膨脹，染色體分散、
　　
　　紅細(xì)胞解體。
　　
　　3．預(yù)固定：加入固定液1～2ml打勻。
　　
　　4．再離心：1000轉(zhuǎn)/分離心8min，吸去上清液，留下沉淀物。
　　
　　5．固定：沿離心管壁加入新配固定液8ml打勻，固定30min。
　　
　　6．再離心：1000轉(zhuǎn)/分離心8min，棄去上清液，留下沉淀物。
　　
　　7．再固定：再加入新配固定液8ml，打勻，靜置30min。
　　
　　8．再離心：1000轉(zhuǎn)/分離心8min，棄去上清液。
　　
　　9．第四次固定：加入新配固定液0.5～lml打勻成細(xì)胞懸液。
　　
　　10．制片：用滴管吸細(xì)胞懸液2～3滴，滴在冰水預(yù)浸泡的潔凈載玻片上，立即用口吹散，在酒精燈上過(guò)幾次，吹風(fēng)機(jī)吹干或氣干。
　　
　　11．染色：Giemsa染液（原液∶pH6.8磷酸緩沖液為1∶9）染色10min～20min、自來(lái)水沖洗、晾干。
　　
　　（四）鏡檢
　　
　　低倍鏡下找到分散良好的分裂相后，換高倍鏡、油鏡、認(rèn)真觀察。
　　
　?。ㄎ澹┳⒁馐马?xiàng)
　　
　　1．PHA是體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵問(wèn)題，因此，要考慮它的質(zhì)量和濃度。鹽水提取物一般冰凍保存的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，時(shí)間長(zhǎng)了效價(jià)減低。
　　
　　2．濃度一般用1％～2％，每毫升培養(yǎng)液加0.2～0.4ml；濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集。
　　
　　3．秋水仙素溶液濃度和處理時(shí)間。一般zui終濃度每毫升培養(yǎng)液0.1～0.2μg為宜，作用時(shí)間為3～5h，一般秋水仙素溶液的濃度與處理時(shí)間有一定的關(guān)系。如果處理時(shí)間太短，則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞就少，相反，如果處理時(shí)間太長(zhǎng)，則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞雖多，但其染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊。
　　
　　4．培養(yǎng)溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在37℃+0.5℃。
　　
　　5．雙蒸水必須用玻璃蒸餾器制備，pH應(yīng)在6～7之間。
　　
　　6．低滲步驟極為重要，關(guān)系到染色體分散的好壞，因此，低滲液濃度與低滲的時(shí)間應(yīng)掌握適當(dāng)。
　　
　　7．離心機(jī)用水平式的，速度不宜過(guò)快。速度太快細(xì)胞團(tuán)不易打散，反之分裂相易丟失；固定液應(yīng)在臨用時(shí)新鮮配制，固定一定要*、均勻。若打散不夠，則細(xì)胞在玻片上易集結(jié)。
　　
　　8．若吹打時(shí)用力過(guò)猛，細(xì)胞易破碎，以致染色體數(shù)目不完整；培養(yǎng)液的pH值應(yīng)掌握在7.4土0.1左右，pH值偏酸發(fā)育不良，偏堿時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)輕度固縮。
　　
　　9．玻璃器皿都要十分干凈、無(wú)酸，所用試劑以分析純?yōu)楹谩?br />　　
　　10．操作過(guò)程應(yīng)保持高度無(wú)菌概念，嚴(yán)防細(xì)菌和病毒污染；在外周血培養(yǎng)中，PHA對(duì)淋巴細(xì)胞的作用，個(gè)體差異較大。同樣方法和條件，分裂相多少及分散情況不一樣。因此，若失敗，應(yīng)充分考慮到這些因素。
　　
　?。ㄎ澹╊A(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
　　
　　將制作好的片子在油鏡下仔細(xì)觀察，選擇較好的分裂相進(jìn)行照相、剪貼、分組，將照片上的核型進(jìn)行剪貼，寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告與實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　
　　染色體數(shù)目為46XX，（XY）為人類正常核型。若某對(duì)染色體少了一條（2n-1），細(xì)胞染色體數(shù)目為45；或某一對(duì)染色體多了一條（2n+1），細(xì)胞染色體數(shù)目為47；若為兩種核型，46，XX/46，XXY稱為嵌合體。以上三種為異常核型。
　　
　　艾本森的生產(chǎn)的紅外線滅菌器已經(jīng)在各個(gè)實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用，為各個(gè)實(shí)驗(yàn)的成功提供了有力的保障。請(qǐng)大家認(rèn)準(zhǔn)ABSON品牌的紅外線滅菌器。